药物研发过程中，明确药物直接作用的靶蛋白，是阐明作用机制、发现新的治疗策略以及推进创新药开发的重要基础。传统药物靶点筛选技术通常需要构建亲和探针，通过化学标记实现蛋白富集。然而，探针修饰可能改变小分子药物的天然结构和结合特性，从而影响实验结果的真实性。近年来，非标记（Label-free）药物靶点发现技术快速发展，其中DARTS（Drug Affinity Responsive Target Stability，药物亲和响应靶点稳定性）因无需修饰药物、实验流程成熟、适用于复杂样本等特点，已成为化学生物学和创新药研发中的经典技术之一。

DARTS技术简介

DARTS技术由Lomenick团队于2008年首次发表于《美国国家科学院院刊》（PNAS），是一种基于蛋白稳定性变化开展药物靶点筛选的方法。

该技术最大的特点在于直接采用未经修饰的原型药物进行实验，不需要引入任何化学标签，因此能够最大程度保留药物原有的结构和活性，更真实地反映药物与蛋白之间的天然结合状态。

经过多年发展，DARTS已广泛应用于天然产物、小分子化合物、中药复方、老药新用及复杂生物样本等多个研究方向。

DARTS技术原理解析

DARTS的理论基础来源于药物结合后蛋白稳定性的改变。

正常情况下，蛋白酶能够识别蛋白分子表面的酶切位点，并将蛋白逐渐降解为多个短肽。

当小分子药物与靶蛋白发生结合后，蛋白空间结构会出现一定程度的重排，使部分酶切位点受到遮挡，整体热力学稳定性发生变化，对蛋白酶降解表现出更强的耐受能力。

经过限制性酶解后，未结合药物的大部分蛋白已被降解，而结合药物的靶蛋白则能够保留较完整的蛋白结构或较长肽段。随后，通过Western Blot（WB）或高分辨率质谱（MS）即可识别这些稳定性发生变化的蛋白，实现候选靶点筛选。

DARTS技术优势分析

DARTS能够成为目前应用最广泛的非标记药物靶点技术之一，与其自身优势密切相关。

首先，无需进行任何化学标记，能够避免探针修饰带来的结构干扰，使药物保持天然结合能力。

其次，实验直接在细胞或组织裂解液中开展，能够较好地保留蛋白天然构象及细胞内微环境，使实验更加接近真实生理状态。

此外，DARTS具有良好的样本兼容性，不仅适用于天然产物和人工合成小分子，也适用于中药复方、组织样本及不同来源裂解液。

相比需要专门探针设计的平台，DARTS实验流程更加成熟，实验成本较低，一般实验室即可建立完整技术体系。

DARTS实验流程

标准DARTS实验通常包括蛋白裂解、药物孵育、限制性酶解和蛋白鉴定四个主要步骤。

首先进行蛋白裂解。一般建议样品蛋白总量不少于3 mg，类器官等复杂样本建议达到5 mg以上，以保证后续检测深度。

裂解过程中推荐采用温和型IP裂解液，例如Beyotime P0013J，不建议采用RIPA等强变性裂解液，以免破坏蛋白天然构象及结合位点。

随后加入药物进行孵育。实验中通常建议终浓度设定为100 μM。由于实验发生在裂解液体系，不涉及细胞毒性，因此较高浓度能够保证靶蛋白充分结合。Martinez Molina于2013年的研究也支持这一实验策略。

药物孵育结束后加入Pronase进行限制性酶解。

需要注意的是，裂解液中加入的蛋白酶抑制剂通常无需去除，因为正式实验所采用的Pronase浓度已经经过梯度优化，可有效平衡抑制剂影响。

完成酶解后，通过SDS-PAGE去除大量小肽段，再利用高分辨率质谱完成蛋白鉴定及定量分析。

DARTS实验数据分析

很多实验人员希望直接通过电泳胶图判断实验效果，但胶图仅能作为初步参考。

由于蛋白条带变化通常较小，真正可靠的数据主要来自高分辨率质谱。

一般情况下，高可信度候选蛋白需满足以下几个指标：

Unique peptide（独有肽段）不少于2条；

FDR（错误发现率）优先选择High（＜0.01）或Medium等级；

P值＜0.05，保证结果具有统计学意义；

Fold Change（FC）达到筛选标准，其中FC＞1.2或＞1.5提示蛋白抗酶解能力增强；FC＜0.833或＜0.667提示结合后稳定性降低，同样属于潜在候选靶点。

当对照组蛋白完全降解导致质谱缺失值时，通常采用1/10th最小值赋值法进行处理，以便完成后续统计分析，提高真实靶点筛选效率。

DARTS与LiP-MS技术区别

目前，DARTS和LiP-MS都是常见的非标记药物靶点发现技术，但检测策略有所不同。

DARTS采用单步限制性酶解，主要评价蛋白整体稳定性变化，因此实验流程较为简单，更适用于复杂真核裂解液、天然产物、中药复方及老药新用研究。

LiP-MS则采用蛋白酶K（PK）联合胰酶两步酶解，通过检测局部肽段变化分析蛋白空间构象改变，更适用于简单体系及代谢物研究。

由于LiP-MS产生大量完全及半消化肽段，在复杂样本中容易形成大量背景信号，高丰度蛋白更容易占据质谱检测资源，从而降低低丰度调控蛋白的检出效率。因此，在复杂哺乳动物样本研究中，DARTS仍然具有明显优势。

DARTS典型应用案例

近年来，DARTS已成功应用于多个药物作用机制研究。

暨南大学研究团队利用DARTS发现抗过敏药氮卓斯汀（Azelastine）能够直接结合ARF1，通过调控线粒体裂变抑制结直肠癌细胞生长。

重庆医科大学研究证实雷公藤红素（Celastrol）直接作用于ChREBP，进一步调控ChREBP-TXNIP信号轴，改善糖尿病并发症。

上海中医药大学利用DARTS发现人参皂苷Rb1能够结合RNA结合蛋白QKI，抑制circ-0034880形成，从而阻断肿瘤肝转移。

中国药科大学则利用DARTS发现真菌来源单体化合物能够直接结合DCTPP1，通过调控氨基酸代谢发挥抗肿瘤作用。

DARTS实验局限性

虽然DARTS具有较好的稳定性和应用价值，但仍需注意其局限性。

首先，非特异性结合可能同样引起蛋白稳定性变化，因此所有候选蛋白均需结合Western Blot、SPR及细胞功能实验进一步验证。

其次，电泳胶图没有明显差异并不能代表实验失败，高分辨率质谱才是最终分析依据。

此外，膜蛋白由于疏水性较高，在裂解液中的提取效率相对较低；复杂翻译后修饰（PTM）蛋白也可能增加质谱鉴定难度。

另外，DARTS能够证明药物与蛋白发生结合，但无法直接说明结合后产生激活还是抑制作用，因此还需要结合后续功能实验进一步阐明作用机制。

总体来看，DARTS作为经典的非标记药物靶点发现技术，凭借无需标记、操作规范、适用于复杂样本及较高的数据可靠性，已经成为创新药研发和天然产物研究的重要技术平台。未来，随着精准蛋白组学、多组学融合以及人工智能辅助分析不断发展，DARTS将在药物靶点发现和精准医疗领域发挥更加重要的价值。

达吉特DARTS技术服务文献：

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